Hvala, ker ste obiskali Nature.com.Uporabljate različico brskalnika z omejeno podporo za CSS.Za najboljšo izkušnjo priporočamo, da uporabite posodobljen brskalnik (ali onemogočite način združljivosti v Internet Explorerju).Poleg tega, da zagotovimo stalno podporo, spletno mesto prikažemo brez slogov in JavaScripta.
Prikaže vrtiljak treh diapozitivov hkrati.Uporabite gumba Prejšnji in Naslednji, da se premikate po treh diapozitivih hkrati, ali pa uporabite gumbe drsnika na koncu, da se premikate skozi tri diapozitive hkrati.
Razvit je bil ultrakompakten (54 × 58 × 8,5 mm) in široko zaslonko (1 × 7 mm) devetbarvni spektrometer, "razdeljen na dvoje" z nizom desetih dihroičnih zrcal, ki je bil uporabljen za takojšnje spektralno slikanje.Vpadni svetlobni tok s presekom, manjšim od velikosti zaslonke, je razdeljen na neprekinjen trak širine 20 nm in devet barvnih tokov s središčnimi valovnimi dolžinami 530, 550, 570, 590, 610, 630, 650, 670 in 690 nm.Slikovni senzor hkrati učinkovito meri slike devetih barvnih tokov.Za razliko od običajnih nizov dihroičnih zrcal ima razviti niz dihroičnih zrcal edinstveno dvodelno konfiguracijo, ki ne samo poveča število barv, ki jih je mogoče meriti hkrati, ampak tudi izboljša ločljivost slike za vsak barvni tok.Razviti devetbarvni spektrometer se uporablja za štirikapilarno elektroforezo.Hkratna kvantitativna analiza osmih barvil, ki migrirajo hkrati v vsaki kapilari, z devetbarvno lasersko inducirano fluorescenco.Ker devetbarvni spektrometer ni le ultra majhen in poceni, ampak ima tudi visok svetlobni tok in zadostno spektralno ločljivost za večino aplikacij spektralnega slikanja, se lahko široko uporablja na različnih področjih.
Hiperspektralno in multispektralno slikanje je postalo pomemben del astronomije2, daljinskega zaznavanja za opazovanje Zemlje3,4, nadzora kakovosti hrane in vode5,6, ohranjanja umetnosti in arheologije7, forenzike8, kirurgije9, biomedicinske analize in diagnostike10,11 itd. Polje 1 Nepogrešljiva tehnologija ,12,13.Metode za merjenje spektra svetlobe, ki jo oddaja vsaka emisijska točka v vidnem polju, so razdeljene na (1) točkovno skeniranje (»metla«)14,15, (2) linearno skeniranje (»metlica«)16,17,18 , (3) valovi skeniranja dolžine19,20,21 in (4) slike22,23,24,25.V primeru vseh teh metod imajo prostorska ločljivost, spektralna ločljivost in časovna ločljivost kompromisno razmerje9,10,12,26.Poleg tega ima svetlobni izhod pomemben vpliv na občutljivost, tj. razmerje med signalom in šumom pri spektralnem slikanju26.Svetlobni tok, torej izkoristek izrabe svetlobe, je premo sorazmeren z razmerjem med dejansko izmerjeno količino svetlobe posamezne svetlobne točke na časovno enoto in celotno količino svetlobe merjenega območja valovnih dolžin.Kategorija (4) je ustrezna metoda, kadar se jakost ali spekter svetlobe, ki jo oddaja vsaka točka oddajanja, spreminja s časom ali ko se položaj vsake točke oddajanja spreminja s časom, ker se spekter svetlobe, ki jo oddajajo vse točke oddajanja, meri hkrati.24.
Večina zgornjih metod je kombinirana z velikimi, kompleksnimi in/ali dragimi spektrometri, ki uporabljajo 18 rešetk ali 14, 16, 22, 23 prizm za razrede (1), (2) in (4) ali 20, 21 filtrirnih diskov, tekočinskih filtrov .Kristalni nastavljivi filtri (LCTF)25 ali akustično-optični nastavljivi filtri (AOTF)19 kategorije (3).V nasprotju s tem so večzrcalni spektrometri kategorije (4) majhni in poceni zaradi svoje preproste konfiguracije 27, 28, 29, 30.Poleg tega imajo visok svetlobni tok, ker se svetloba, ki si jo deli vsako dihroično ogledalo (to je prepuščena in odbita svetloba vpadne svetlobe na vsakem dihroičnem zrcalu), v celoti in neprekinjeno uporablja.Vendar pa je število pasov valovnih dolžin (tj. barv), ki jih je treba meriti hkrati, omejeno na približno štiri.
Spektralno slikanje, ki temelji na detekciji fluorescence, se običajno uporablja za multipleksno analizo v biomedicinski detekciji in diagnostiki 10, 13.Ker je pri multipleksiranju več analitov (npr. specifične DNK ali proteinov) označenih z različnimi fluorescenčnimi barvili, se vsak analit, ki je prisoten na vsaki emisijski točki v vidnem polju, kvantificira z uporabo večkomponentne analize.32 razčleni zaznan spekter fluorescence, ki ga oddaja vsaka emisijska točka.Med tem procesom se lahko različna barvila, od katerih vsako oddaja drugačno fluorescenco, kolokalizirajo, to je soobstoj v prostoru in času.Trenutno je največje število barvil, ki jih lahko vzbudi en laserski žarek, osem33.Ta zgornja meja ni določena s spektralno ločljivostjo (tj. številom barv), temveč s širino fluorescenčnega spektra (≥50 nm) in količino Stokesovega premika barvila (≤200 nm) pri FRET (z uporabo FRET)10 .Vendar pa mora biti število barv večje ali enako številu barvil, da se odpravi spektralno prekrivanje mešanih barvil31,32.Zato je treba povečati število sočasno izmerjenih barv na osem ali več.
Pred kratkim je bil razvit ultrakompaktni heptihroični spektrometer (z nizom heptihroičnih zrcal in slikovnim senzorjem za merjenje štirih fluorescentnih tokov).Spektrometer je dva do tri velikostne rede manjši od običajnih spektrometrov, ki uporabljajo rešetke ali prizme34,35.Vendar pa je težko postaviti več kot sedem dihroičnih zrcal v spektrometer in hkrati meriti več kot sedem barv36,37.S povečanjem števila dihroičnih zrcal se poveča največja razlika v dolžinah optičnih poti dihroičnih svetlobnih tokov in postane težko prikazati vse svetlobne tokove na eni senzorični ravnini.Poveča se tudi najdaljša optična pot svetlobnega toka, zato se zmanjša širina odprtine spektrometra (tj. največja širina svetlobe, ki jo analizira spektrometer).
Kot odgovor na zgornje težave je bil razvit ultrakompaktni devetbarvni spektrometer z dvoslojnim "dihroičnim" dekakromatskim nizom zrcal in slikovnim senzorjem za takojšnje spektralno slikanje [kategorija (4)].V primerjavi s predhodnimi spektrometri ima razviti spektrometer manjšo razliko v največji dolžini optične poti in manjšo največjo dolžino optične poti.Uporabili so ga pri štirikapilarni elektroforezi za odkrivanje lasersko inducirane devetbarvne fluorescence in kvantificiranje hkratne migracije osmih barvil v vsaki kapilari.Ker razviti spektrometer ni le ultra majhen in poceni, ampak ima tudi visok svetlobni tok in zadostno spektralno ločljivost za večino aplikacij spektralnega slikanja, se lahko široko uporablja na različnih področjih.
Tradicionalni devetbarvni spektrometer je prikazan na sl.1a.Njegova zasnova sledi tistemu prejšnjega ultra-majhnega sedembarvnega spektrometra 31. Sestavljen je iz devetih dihroičnih zrcal, ki so razporejena vodoravno pod kotom 45° v desno, slikovni senzor (S) pa se nahaja nad devetimi dihroičnimi zrcali.Svetloba, ki vstopa od spodaj (C0), je razdeljena z nizom devetih dihroičnih zrcal v devet svetlobnih tokov, ki gredo navzgor (C1, C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8 in C9).Vseh devet barvnih tokov se dovede neposredno do slikovnega tipala in se zaznajo hkrati.V tej študiji so C1, C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8 in C9 razvrščeni po valovnih dolžinah in so predstavljeni z magento, vijolično, modro, cian, zeleno, rumeno, oranžno, rdeče-oranžno in rdeče oz.Čeprav so te barvne oznake uporabljene v tem dokumentu, kot je prikazano na sliki 3, ker se razlikujejo od dejanskih barv, ki jih vidi človeško oko.
Shematski diagrami običajnih in novih devetbarvnih spektrometrov.(a) Običajni devetbarvni spektrometer z nizom devetih dihroičnih zrcal.( b ) Nov devetbarvni spektrometer z dvoslojnim nizom dihroičnih zrcal.Vpadni svetlobni tok C0 je razdeljen na devet barvnih svetlobnih tokov C1-C9 in jih zazna slikovni senzor S.
Razviti novi devetbarvni spektrometer ima dvoslojno dikroično zrcalno rešetko in slikovni senzor, kot je prikazano na sliki 1b.V spodnjem nivoju je pet dihroičnih zrcal nagnjenih za 45° v desno, poravnanih v desno od središča niza dekamerjev.Na zgornji ravni je pet dodatnih dihroičnih zrcal nagnjenih za 45° v levo in se nahajajo od sredine proti levi.Skrajno levo dihroično zrcalo spodnje plasti in skrajno desno dihroično zrcalo zgornje plasti se prekrivata.Vpadni svetlobni tok (C0) je od spodaj razdeljen na štiri izhodne kromatične tokove (C1-C4) s petimi dihroičnimi zrcali na desni in pet izhodnih kromatičnih tokov (C5-C4) s petimi dihroičnimi zrcali na levi C9).Tako kot pri običajnih devetbarvnih spektrometrih se vseh devet barvnih tokov neposredno vbrizga v slikovni senzor (S) in zazna istočasno.Če primerjamo sliki 1a in 1b, lahko vidimo, da sta v primeru novega devetbarvnega spektrometra tako največja razlika kot najdaljša dolžina optične poti devetih barvnih tokov prepolovljeni.
Podrobna konstrukcija ultra-majhnega niza dvoslojnih dihroičnih zrcal 29 mm (širina) × 31 mm (globina) × 6 mm (višina) je prikazana na sliki 2. Niz decimalnih dihroičnih zrcal je sestavljen iz petih dihroičnih zrcal na desni strani (M1-M5) in pet dihroičnih zrcal na levi (M6-M9 in drugo M5), vsako dihroično zrcalo je pritrjeno na zgornji aluminijasti nosilec.Vsa dihroična zrcala so zamaknjena, da se kompenzira vzporedni premik zaradi loma toka skozi zrcala.Pod M1 je pritrjen pasovni filter (BP).Mere M1 in BP so 10 mm (dolga stran) x 1,9 mm (kratka stran) x 0,5 mm (debelina).Dimenzije preostalih dihroičnih zrcal so 15 mm × 1,9 mm × 0,5 mm.Razmik matrice med M1 in M2 je 1,7 mm, medtem ko je korak matrice drugih dihroičnih zrcal 1,6 mm.Na sl.2c združuje vpadni svetlobni tok C0 in devet barvnih svetlobnih tokov C1-C9, ločenih z de-chamber matriko zrcal.
Konstrukcija dvoslojne dihroične zrcalne matrice.(a) Pogled v perspektivi in (b) pogled v prerezu dvoslojnega dihroičnega zrcalnega niza (dimenzije 29 mm x 31 mm x 6 mm).Sestavljen je iz petih dihroičnih zrcal (M1-M5), ki se nahajajo v spodnji plasti, petih dihroičnih zrcal (M6-M9 in drugo M5), ki se nahajajo v zgornji plasti, in pasovnega filtra (BP), ki se nahaja pod M1.(c) Prečni prerez v navpični smeri, s prekrivanjem C0 in C1-C9.
Širina odprtine v vodoravni smeri, označena s širino C0 na sliki 2, c, je 1 mm, v smeri, pravokotni na ravnino slike 2, c, ki jo določa zasnova aluminijastega nosilca, – 7 mm.To pomeni, da ima novi devetbarvni spektrometer veliko velikost zaslonke 1 mm × 7 mm.Optična pot C4 je najdaljša med C1-C9, optična pot C4 znotraj niza dihroičnega zrcala pa je zaradi zgornje ultra-majhne velikosti (29 mm × 31 mm × 6 mm) 12 mm.Hkrati je dolžina optične poti C5 najkrajša med C1-C9, dolžina optične poti C5 pa je 5,7 mm.Zato je največja razlika v dolžini optične poti 6,3 mm.Zgornje dolžine optične poti so popravljene za dolžino optične poti za optični prenos M1-M9 in BP (iz kremena).
Spektralne lastnosti M1−M9 in VR so izračunane tako, da so tokovi С1, С2, С3, С4, С5, С6, С7, С8 in С9 v območju valovnih dolžin 520–540, 540–560, 560–580, 580. –600, 600–620, 620–640, 640–660, 660–680 in 680–700 nm.
Fotografija izdelane matrice dekakromatskih zrcal je prikazana na sliki 3a.M1-M9 in BP sta prilepljena na 45-stopinjski naklon oziroma vodoravno ravnino aluminijastega nosilca, medtem ko sta M1 in BP skrita na zadnji strani figure.
Izdelava niza dekanskih ogledal in njena predstavitev.(a) Niz izdelanih dekakromatskih zrcal.( b ) Devetbarvna deljena slika velikosti 1 mm × 7 mm, projicirana na list papirja, postavljen pred niz dekakromatskih ogledal in osvetljena z belo svetlobo.(c) Niz dekokromatskih zrcal, osvetljenih z belo svetlobo od zadaj.(d) Devetbarvni razcepni tok, ki izvira iz niza zrcalnih dekanov, opazovan tako, da se pred niz zrcalnih dekanov pri c postavi z dimom napolnjena akrilna posoda in zatemni prostor.
Izmerjeni transmisijski spekter M1-M9 C0 pri vpadnem kotu 45° in izmerjeni transmisijski spekter BP C0 pri vpadnem kotu 0° sta prikazana na sl.4a.Transmisijski spektri C1-C9 glede na C0 so prikazani na sl.4b.Ti spektri so bili izračunani iz spektrov na sl.4a v skladu z optično potjo C1-C9 na sliki 4a.1b in 2c.Na primer, TS(C4) = TS (BP) × [1 − TS (M1)] × TS (M2) × TS (M3) × TS (M4) × [1 − TS (M5)], TS(C9 ) = TS (BP) × TS (M1) × [1 − TS (M6)] × TS (M7) × TS (M8) × TS (M9) × [1 − TS (M5)], kjer sta TS(X) in [ 1 − TS(X)] sta prepustni oziroma odbojni spekter X.Kot je prikazano na sliki 4b, so pasovne širine (pasovna širina ≥50 %) C1, C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8 in C9 521-540, 541-562, 563-580, 581-602, 603 -623, 624-641, 642-657, 659-680 in 682-699 nm.Ti rezultati so skladni z razvitimi razponi.Poleg tega je učinkovitost izkoriščanja svetlobe C0 visoka, kar pomeni, da je povprečna največja prepustnost svetlobe C1-C9 92 %.
Transmisijski spektri dihroičnega zrcala in razcepljenega devetbarvnega toka.(a) Izmerjeni transmisijski spektri M1-M9 pri incidenci 45 ° in BP pri incidenci 0 °.(b) Transmisijski spektri C1–C9 glede na C0, izračunani iz (a).
Na sl.Kot je prikazano na sliki 3c, je niz dihroičnih zrcal nameščen navpično, tako da je njegova desna stran na sliki 3a zgornja stran in je beli žarek kolimirane LED (C0) osvetljen od zadaj.Niz dekakromatskih zrcal, prikazanih na sliki 3a, je nameščen v adapterju 54 mm (višina) × 58 mm (globina) × 8,5 mm (debelina).Na sl.3d, poleg stanja, prikazanega na sl.3c je bila z dimom napolnjena akrilna posoda postavljena pred niz dekokromatskih ogledal, pri čemer so bile luči v sobi ugasnjene.Posledično je v rezervoarju vidnih devet dihroičnih tokov, ki izhajajo iz niza dekatroičnih zrcal.Vsak razcepljeni tok ima pravokoten presek z dimenzijami 1 × 7 mm, kar ustreza velikosti zaslonke novega devetbarvnega spektrometra.Na sliki 3b je list papirja postavljen pred niz dihroičnih zrcal na sliki 3c in slika 1 x 7 mm devetih dihroičnih tokov, projiciranih na papir, je opazovana iz smeri gibanja papirja.tokovi.Devet tokov ločevanja barv na sl.3b in d so C4, C3, C2, C1, C5, C6, C7, C8 in C9 od zgoraj navzdol, kar lahko vidite tudi na slikah 1 in 2. 1b in 2c.Opazujemo jih v barvah, ki ustrezajo njihovim valovnih dolžinam.Zaradi nizke intenzivnosti bele svetlobe LED (glej dodatno sliko S3) in občutljivosti barvne kamere, uporabljene za zajem C9 (682–699 nm) na sliki. Drugi tokovi delitve so šibki.Podobno je bil C9 slabo viden s prostim očesom.Medtem je C2 (drugi tok od vrha) na sliki 3 videti zelen, vendar je s prostim očesom videti bolj rumen.
Prehod s slike 3c na d je prikazan v dodatnem videu 1. Takoj po tem, ko bela svetloba iz LED preide skozi niz dekakromatskih zrcal, se istočasno razdeli na devet barvnih tokov.Na koncu se je dim v kadi postopoma razblinil od zgoraj navzdol, tako da je tudi devet barvnih prahov izginilo od zgoraj navzdol.Nasprotno pa je v dodatnem videu 2, ko je bila valovna dolžina svetlobnega toka, ki vpada v niz dekakromatskih zrcal, spremenjena iz dolge v kratko v vrstnem redu 690, 671, 650, 632, 610, 589, 568, 550 in 532 nm ., Prikazani so samo ustrezni razdeljeni tokovi od devetih razdeljenih tokov v vrstnem redu C9, C8, C7, C6, C5, C4, C3, C2 in C1.Akrilni rezervoar je nadomeščen s kremenčevim bazenom, kosmiče vsakega preusmerjenega toka pa je mogoče jasno opazovati iz nagnjene smeri navzgor.Poleg tega je pod-video 3 urejen tako, da se del pod-video 2 s spremembo valovne dolžine ponovno predvaja.To je najbolj zgovoren izraz značilnosti dekokromatskega niza zrcal.
Zgornji rezultati kažejo, da izdelani dekakromatski zrcalni niz ali novi devetbarvni spektrometer deluje, kot je predvideno.Novi devetbarvni spektrometer je oblikovan z namestitvijo niza dekakromatskih zrcal z adapterji neposredno na ploščo slikovnega senzorja.
Svetlobni tok z razponom valovnih dolžin od 400 do 750 nm, ki ga oddajajo štiri točke sevanja φ50 μm, ki se nahajajo v intervalih 1 mm v smeri, pravokotni na ravnino slike 2c, oziroma Raziskave 31, 34. Niz štirih leč je sestavljen iz štiri leče φ1 mm z goriščno razdaljo 1,4 mm in razmikom 1 mm.Štirje kolimirani tokovi (štirje C0) vpadajo na DP novega devetbarvnega spektrometra, razporejeni v intervalih 1 mm.Niz dihroičnih zrcal razdeli vsak tok (C0) v devet barvnih tokov (C1-C9).Nastalih 36 tokov (štirje sklopi C1-C9) se nato vbrizga neposredno v slikovni senzor CMOS (S), neposredno povezan z nizom dihroičnih zrcal.Kot rezultat, kot je prikazano na sliki 5a, so bile zaradi majhne največje razlike v optični poti in kratke največje optične poti slike vseh 36 tokov zaznane hkrati in jasno z enako velikostjo.Glede na spodnje spektre (glej dodatno sliko S4) je intenzivnost slike štirih skupin C1, C2 in C3 relativno nizka.Šestintrideset slik je bilo velikosti 0,57 ± 0,05 mm (povprečje ± SD).Tako je bila povečava slike v povprečju 11,4.Navpični razmik med slikami je v povprečju 1 mm (enak razmik kot pri nizu leč) in vodoravni razmik v povprečju 1,6 mm (enak razmik kot pri nizu dihroičnih zrcal).Ker je velikost slike veliko manjša od razdalje med slikama, je mogoče vsako sliko izmeriti neodvisno (z nizkim presluhom).Medtem so slike osemindvajsetih tokov, posnetih s konvencionalnim sedembarvnim spektrometrom, uporabljenim v naši prejšnji študiji, prikazane na sliki 5 B. Niz sedmih dihroičnih zrcal je bil ustvarjen z odstranitvijo dveh skrajnih desnih dihroičnih zrcal iz niza devetih dihroičnih zrcal. ogledala na sliki 1a.Vse slike niso ostre, velikost slike se poveča od C1 do C7.Osemindvajset slik je velikosti 0,70 ± 0,19 mm.Zato je težko vzdrževati visoko ločljivost slike na vseh slikah.Koeficient variacije (CV) za velikost slike 28 na sliki 5b je bil 28 %, medtem ko se je CV za velikost slike 36 na sliki 5a zmanjšal na 9 %.Zgornji rezultati kažejo, da novi devetbarvni spektrometer ne le poveča število sočasno izmerjenih barv s sedem na devet, ampak ima tudi visoko ločljivost slike za vsako barvo.
Primerjava kakovosti razcepljene slike, ki jo tvorijo klasični in novi spektrometri.(a) Štiri skupine devetbarvno ločenih slik (C1-C9), ki jih ustvari novi devetbarvni spektrometer.(b) Štirje nizi sedembarvno ločenih slik (C1-C7), oblikovanih z običajnim sedembarvnim spektrometrom.Tokovi (C0) z valovno dolžino od 400 do 750 nm iz štirih emisijskih točk so kolimirani in vpadejo na vsak spektrometer posebej.
Spektralne značilnosti devetbarvnega spektrometra so bile ovrednotene eksperimentalno in rezultati vrednotenja so prikazani na sliki 6. Upoštevajte, da slika 6a prikazuje enake rezultate kot slika 5a, tj. pri valovnih dolžinah 4 C0 400–750 nm je zaznanih vseh 36 slik. (4 skupine C1–C9).Nasprotno, kot je prikazano na slikah 6b–j, ko ima vsak C0 določeno valovno dolžino 530, 550, 570, 590, 610, 630, 650, 670 ali 690 nm, obstajajo skoraj samo štiri ustrezne slike (štiri skupine C1, C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8 ali C9).Vendar pa so nekatere slike, ki mejijo na štiri ustrezne slike, zelo slabo zaznane, ker se transmisijski spektri C1–C9, prikazani na sliki 4b, rahlo prekrivajo in ima vsak C0 pas 10 nm pri določeni valovni dolžini, kot je opisano v metodi.Ti rezultati so skladni s transmisijskimi spektri C1-C9, prikazanimi na sl.4b in dodatna videa 2 in 3. Z drugimi besedami, devetbarvni spektrometer deluje po pričakovanjih glede na rezultate, prikazane na sl.4b.Zato se sklepa, da je porazdelitev intenzivnosti slike C1-C9 spekter vsakega C0.
Spektralne značilnosti devetbarvnega spektrometra.Novi devetbarvni spektrometer ustvari štiri nize devetbarvno ločenih slik (C1-C9), ko ima vpadna svetloba (štirje C0) valovno dolžino (a) 400–750 nm (kot je prikazano na sliki 5a), (b) 530 nm.nm, (c) 550 nm, (d) 570 nm, (e) 590 nm, (f) 610 nm, (g) 630 nm, (h) 650 nm, (i) 670 nm, (j) 690 nm, oz.
Razviti devetbarvni spektrometer je bil uporabljen za štirikapilarno elektroforezo (za podrobnosti glejte dopolnilne materiale) 31, 34, 35.Štirikapilarni matriks je sestavljen iz štirih kapilar (zunanji premer 360 μm in notranji premer 50 μm), ki se nahajajo v intervalih 1 mm na mestu laserskega obsevanja.Vzorci, ki vsebujejo fragmente DNA, označene z 8 barvili, in sicer FL-6C (barvilo 1), JOE-6C (barvilo 2), dR6G (barvilo 3), TMR-6C (barvilo 4), CXR-6C (barvilo 5), TOM- 6C (barvilo 6), LIZ (barvilo 7) in WEN (barvilo 8) v naraščajočem vrstnem redu glede na fluorescentno valovno dolžino, ločeno v vsaki od štirih kapilar (v nadaljevanju imenovanih Cap1, Cap2, Cap3 in Cap4).Lasersko inducirana fluorescenca iz Cap1-Cap4 je bila kolimirana z nizom štirih leč in istočasno zabeležena z devetbarvnim spektrometrom.Dinamika intenzivnosti devetbarvne (C1-C9) fluorescence med elektroforezo, to je devetbarvni elektroforegram vsake kapilare, je prikazana na sliki 7a.Enakovreden devetbarvni elektroforegram dobimo v Cap1-Cap4.Kot je prikazano s puščicami Cap1 na sliki 7a, osem vrhov na vsakem devetbarvnem elektroforegramu prikazuje eno fluorescenčno emisijo iz Dye1-Dye8.
Hkratna kvantifikacija osmih barvil z uporabo devetbarvnega štirikapilarnega spektrometra za elektroforezo.(a) Devetbarvni (C1-C9) elektroforegram vsake kapilare.Osem vrhov, označenih s puščicami Cap1, prikazuje posamezne fluorescenčne emisije osmih barvil (Dye1-Dye8).Barvi puščic ustrezata barvama (b) in (c).(b) Fluorescenčni spektri osmih barvil (Dye1-Dye8) na kapilaro.c Elektroferogrami osmih barvil (Dye1-Dye8) na kapilaro.Vrhovi fragmentov DNA, označenih z Dye7, so označeni s puščicami, njihove osnovne dolžine Cap4 pa so označene.
Porazdelitve intenzivnosti C1–C9 na osmih vrhovih so prikazane na sl.7b oz.Ker sta C1-C9 in Dye1-Dye8 v vrstnem redu valovnih dolžin, osem porazdelitev na sliki 7b prikazuje fluorescenčne spektre Dye1-Dye8 zaporedno od leve proti desni.V tej študiji se Dye1, Dye2, Dye3, Dye4, Dye5, Dye6, Dye7 in Dye8 pojavljajo v magenta, vijolični, modri, cian, zeleni, rumeni, oranžni in rdeči.Upoštevajte, da barve puščic na sliki 7a ustrezajo barvam barvila na sliki 7b.Intenzivnosti fluorescence C1-C9 za vsak spekter na sliki 7b so bile normalizirane tako, da je njihova vsota enaka ena.Osem enakovrednih fluorescenčnih spektrov je bilo pridobljenih iz Cap1-Cap4.Jasno je mogoče opaziti spektralno prekrivanje fluorescence med barvilom 1 in barvilom 8.
Kot je prikazano na sliki 7c, je bil za vsako kapilaro devetbarvni elektroforegram na sliki 7a pretvorjen v elektroferogram z osmimi barvili z večkomponentno analizo na podlagi osmih fluorescenčnih spektrov na sliki 7b (za podrobnosti glejte dodatne materiale).Ker spektralno prekrivanje fluorescence na sliki 7a ni prikazano na sliki 7c, je mogoče Dye1-Dye8 identificirati in kvantificirati posamezno v vsaki časovni točki, tudi če različne količine Dye1-Dye8 fluorescirajo hkrati.Tega ni mogoče doseči s tradicionalnim zaznavanjem sedmih barv31, vendar se lahko doseže z razvitim zaznavanjem devetih barv.Kot je prikazano s puščicami Cap1 na sliki 7c, so samo fluorescenčne emisije singletov Dye3 (modra), Dye8 (rdeča), Dye5 (zelena), Dye4 (cian), Dye2 (vijolična), Dye1 (magenta) in Dye6 (rumena). ) se opazujejo v pričakovanem kronološkem vrstnem redu.Za fluorescenčno emisijo barvila 7 (oranžno) je bilo poleg posameznega vrha, označenega z oranžno puščico, opaženih več drugih posameznih vrhov.Ta rezultat je posledica dejstva, da so vzorci vsebovali standarde velikosti, Dye7 označene fragmente DNK z različnimi osnovnimi dolžinami.Kot je prikazano na sliki 7c, so te osnovne dolžine za Cap4 20, 40, 60, 80, 100, 114, 120, 140, 160, 180, 200, 214 in 220 osnovnih dolžin.
Glavni značilnosti devetbarvnega spektrometra, razvitega z uporabo matrike dvoslojnih dihroičnih zrcal, sta majhnost in preprosta zasnova.Ker niz dekakromatskih zrcal znotraj adapterja, prikazanega na sl.3c, nameščen neposredno na ploščo slikovnega senzorja (glej sliki S1 in S2), ima devetbarvni spektrometer enake dimenzije kot adapter, tj. 54 × 58 × 8,5 mm.(debelina).Ta izjemno majhna velikost je dva do tri velikosti manjša od običajnih spektrometrov, ki uporabljajo rešetke ali prizme.Ker je poleg tega devetbarvni spektrometer konfiguriran tako, da svetloba pada na površino slikovnega senzorja pravokotno, je mogoče zlahka dodeliti prostor za devetbarvni spektrometer v sistemih, kot so mikroskopi, pretočni citometri ali analizatorji.Analizator elektroforeze s kapilarno rešetko za še večjo miniaturizacijo sistema.Hkrati je velikost desetih dihroičnih zrcal in pasovnih filtrov, uporabljenih v devetbarvnem spektrometru, le 10×1,9×0,5 mm ali 15×1,9×0,5 mm.Tako je več kot 100 takih majhnih dihroičnih zrcal oziroma pasovnih filtrov mogoče izrezati iz dihroičnega zrcala oziroma 60 mm2 pasovnega filtra.Zato je niz dekakromatskih zrcal mogoče izdelati po nizki ceni.
Druga značilnost devetbarvnega spektrometra so njegove odlične spektralne lastnosti.Omogoča predvsem zajem spektralnih slik posnetkov, torej hkratni zajem slik s spektralno informacijo.Za vsako sliko je bil pridobljen neprekinjen spekter z razponom valovnih dolžin od 520 do 700 nm in ločljivostjo 20 nm.Z drugimi besedami, za vsako sliko je zaznanih devet barvnih intenzivnosti svetlobe, tj. devet 20 nm pasov, ki enakomerno delijo območje valovnih dolžin od 520 do 700 nm.S spreminjanjem spektralnih karakteristik dihroičnega zrcala in pasovnega filtra je mogoče prilagoditi obseg valovnih dolžin devetih pasov in širino vsakega pasu.Zaznavanje devetih barv se lahko uporablja ne samo za meritve fluorescence s spektralnim slikanjem (kot je opisano v tem poročilu), ampak tudi za številne druge običajne aplikacije, ki uporabljajo spektralno slikanje.Čeprav lahko hiperspektralno slikanje zazna na stotine barv, je bilo ugotovljeno, da je mogoče celo z znatnim zmanjšanjem števila zaznavnih barv več predmetov v vidnem polju identificirati z dovolj natančnostjo za številne aplikacije38,39,40.Ker imajo prostorska ločljivost, spektralna ločljivost in časovna ločljivost kompromis pri spektralnem slikanju, lahko zmanjšanje števila barv izboljša prostorsko ločljivost in časovno ločljivost.Uporablja lahko tudi preproste spektrometre, kot je tisti, razvit v tej študiji, in dodatno zmanjša količino računanja.
V tej študiji je bilo kvantificiranih osem barvil hkrati s spektralno ločitvijo njihovih prekrivajočih se spektrov fluorescence na podlagi detekcije devetih barv.Istočasno je mogoče kvantificirati do devet barvil, ki soobstajajo v času in prostoru.Posebna prednost devetbarvnega spektrometra je visok svetlobni tok in velika zaslonka (1 × 7 mm).Zrcalni niz dekanov ima največjo prepustnost 92 % svetlobe iz zaslonke v vsakem od devetih območij valovnih dolžin.Učinkovitost uporabe vpadne svetlobe v območju valovnih dolžin od 520 do 700 nm je skoraj 100 %.V tako širokem razponu valovnih dolžin nobena uklonska mreža ne more zagotoviti tako visoke učinkovitosti uporabe.Tudi če uklonska učinkovitost uklonske rešetke preseže 90 % pri določeni valovni dolžini, ko se razlika med to valovno dolžino in določeno valovno dolžino poveča, se uklonska učinkovitost pri drugi valovni dolžini zmanjša41.Širina zaslonke, ki je pravokotna na smer ravnine na sliki 2c, se lahko razširi s 7 mm na širino slikovnega senzorja, kot je v primeru slikovnega senzorja, uporabljenega v tej študiji, z rahlo spremembo niza dekamerjev.
Devetbarvni spektrometer se lahko uporablja ne samo za kapilarno elektroforezo, kot je prikazano v tej študiji, ampak tudi za različne druge namene.Na primer, kot je prikazano na spodnji sliki, lahko devetbarvni spektrometer uporabimo za fluorescenčni mikroskop.Ravnina vzorca je prikazana na slikovnem senzorju devetbarvnega spektrometra skozi 10x objektiv.Optična razdalja med lečo objektiva in slikovnim senzorjem je 200 mm, medtem ko je optična razdalja med vpadno površino devetbarvnega spektrometra in slikovnim senzorjem le 12 mm.Zato smo sliko razrezali na približno velikost odprtine (1 × 7 mm) v vpadni ravnini in razdelili na devet barvnih slik.To pomeni, da lahko spektralno sliko devetbarvnega posnetka posnamemo na površini 0,1 × 0,7 mm v vzorčni ravnini.Poleg tega je mogoče pridobiti devetbarvno spektralno sliko večjega območja na vzorčni ravnini s skeniranjem vzorca glede na objektiv v vodoravni smeri na sliki 2c.
Dekakromatične zrcalne nize komponent, in sicer M1-M9 in BP, je po meri izdelalo podjetje Asahi Spectra Co., Ltd. z uporabo standardnih metod obarjanja.Večplastne dielektrične materiale smo posamezno nanesli na deset kremenčevih plošč velikosti 60 × 60 mm in debeline 0,5 mm, ki izpolnjujejo naslednje zahteve: M1: IA = 45°, R ≥ 90 % pri 520–590 nm, Tave ≥ 90 % pri 610– 610 nm.700 nm, M2: IA = 45°, R ≥ 90 % pri 520–530 nm, Tave ≥ 90 % pri 550–600 nm, M3: IA = 45 °, R ≥ 90 % pri 540–550 nm, Tave ≥ 90 % pri 570–600 nm, M4: IA = 45°, R ≥ 90 % pri 560–570 nm, Tave ≥ 90 % pri 590–600 nm, M5: IA = 45 °, R ≥ 98 % pri 580–600 nm , R ≥ 98 % pri 680–700 nm, M6: IA = 45°, Tave ≥ 90 % pri 600–610 nm, R ≥ 90 % pri 630–700 nm, M7: IA = 45 °, R ≥ 90 % pri 620–630 nm, Taw ≥ 90 % pri 650–700 nm, M8: IA = 45°, R ≥ 90 % pri 640–650 nm, Taw ≥ 90 % pri 670–700 nm, M9: IA = 45°, R ≥ 90 % pri 650–670 nm, Tave ≥ 90 % pri 690–700 nm, BP: IA = 0°, T ≤ 0,01 % pri 505 nm, Tave ≥ 95 % pri 530–690 nm pri 530 nm T ≥ 90 % pri -690 nm in T ≤ 1 % pri 725-750 nm, kjer so IA, T, Tave in R vpadni kot, prepustnost, povprečna prepustnost in odbojnost nepolarizirane svetlobe.
Bela svetloba (C0) z razponom valovnih dolžin 400–750 nm, ki jo oddaja svetlobni vir LED (AS 3000, AS ONE CORPORATION), je bila kolimirana in vpadla navpično na DP niza dihroičnih zrcal.Spekter bele svetlobe LED je prikazan na dodatni sliki S3.Postavite akrilni rezervoar (dimenzije 150 × 150 × 30 mm) neposredno pred zrcalni niz dekamer, nasproti PSU.Dim, ki je nastal ob potopitvi suhega ledu v vodo, je bil nato zlit v akrilno posodo, da bi opazovali devetbarvne deljene tokove C1-C9, ki izhajajo iz niza dekakromatskih zrcal.
Druga možnost je, da se kolimirana bela svetloba (C0) spusti skozi filter, preden vstopi v DP.Filtri so bili prvotno filtri nevtralne gostote z optično gostoto 0,6.Nato uporabite motorni filter (FW212C, FW212C, Thorlabs).Nazadnje ponovno vklopite ND filter.Pasovne širine devetih pasovnih filtrov ustrezajo C9, C8, C7, C6, C5, C4, C3, C2 oziroma C1.Kvarčna celica z notranjimi dimenzijami 40 (optična dolžina) x 42,5 (višina) x 10 mm (širina) je bila postavljena pred niz dekokromatskih zrcal, nasproti BP.Dim se nato dovaja skozi cev v kvarčno celico, da se ohrani koncentracija dima v kvarčni celici, da se vizualizirajo devetbarvni deljeni tokovi C1-C9, ki izvirajo iz dekakromatskega zrcalnega niza.
Videoposnetek devetbarvnega deljenega svetlobnega toka, ki izhaja iz niza dekanskih zrcal, je bil posnet v načinu časovnega zamika na iPhone XS.Zajemite slike prizora pri 1 sličici na sekundo in sestavite slike, da ustvarite videoposnetek s 30 sličicami na sekundo (za izbirni video 1) ali 24 sličic na sekundo (za izbirna videa 2 in 3).
Na difuzijsko ploščo položite 50 µm debelo ploščo iz nerjavečega jekla (s štirimi luknjami s premerom 50 µm v intervalih 1 mm).Na difuzorsko ploščo se obseva svetloba z valovno dolžino 400-750 nm, ki jo dobimo s prehodom svetlobe halogenske žarnice skozi kratkoprepustni filter z mejno valovno dolžino 700 nm.Svetlobni spekter je prikazan na dodatni sliki S4.Druga možnost je, da gre svetloba tudi skozi enega od 10 nm pasovnih filtrov s središčem pri 530, 550, 570, 590, 610, 630, 650, 670 in 690 nm in zadene ploščo difuzorja.Posledično so se na plošči iz nerjavečega jekla nasproti plošče difuzorja oblikovale štiri sevalne točke s premerom φ50 μm in različnimi valovno dolžinami.
Niz štirih kapilar s štirimi lečami je nameščen na devetbarvni spektrometer, kot je prikazano na slikah 1 in 2. C1 in C2.Štiri kapilare in štiri leče so bile enake kot v prejšnjih študijah31,34.Laserski žarek z valovno dolžino 505 nm in močjo 15 mW obseva istočasno in enakomerno od strani do emisijskih točk štirih kapilar.Fluorescenco, ki jo oddaja vsaka emisijska točka, kolimira ustrezna leča in loči na devet barvnih tokov z nizom dekakromatskih zrcal.Nastalih 36 tokov je bilo nato neposredno vbrizganih v slikovni senzor CMOS (C11440–52U, Hamamatsu Photonics K·K.) in njihove slike so bile hkrati posnete.
ABI PRISM® BigDye® Primer Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Applied Biosystems), 4 µl GeneScan™ 600 LIZ™ barvila smo zmešali za vsako kapilaro z mešanjem 1 µl PowerPlex® 6C Matrix Standard (Promega Corporation), 1 µl standarda velikosti mešanice.v2.0 (Thermo Fisher Scientific) in 14 µl vode.Matrični standard PowerPlex® 6C je sestavljen iz šestih fragmentov DNK, označenih s šestimi barvili: FL-6C, JOE-6C, TMR-6C, CXR-6C, TOM-6C in WEN, po vrstnem redu največje valovne dolžine.Osnovne dolžine teh fragmentov DNK niso razkrite, znana pa je sekvenca osnovnih dolžin fragmentov DNK, označenih z WEN, CXR-6C, TMR-6C, JOE-6C, FL-6C in TOM-6C.Mešanica v kompletu ABI PRISM® BigDye® Primer Cycle Sequencing Ready Reaction Kit vsebuje fragment DNK, označen z barvilom dR6G.Tudi dolžine baz fragmentov DNK niso razkrite.GeneScan™ 600 LIZ™ Dye Size Standard v2.0 vključuje 36 fragmentov DNK, označenih z LIZ.Osnovne dolžine teh fragmentov DNK so 20, 40, 60, 80, 100, 114, 120, 140, 160, 180, 200, 214, 220, 240, 250, 260, 280, 300, 314, 320, 340, 360, 380, 400, 414, 420, 440, 460, 480, 500, 514, 520, 540, 560, 580 in 600 osnova.Vzorci so bili denaturirani pri 94 °C 3 minute, nato ohlajeni na ledu 5 minut.Vzorci so bili vbrizgani v vsako kapilaro pri 26 V/cm za 9 s in ločeni v vsaki kapilari, napolnjeni z raztopino polimera POP-7™ (Thermo Fisher Scientific) z efektivno dolžino 36 cm in napetostjo 181 V/cm ter kotom 60°.OD.
Vsi podatki, pridobljeni ali analizirani med to študijo, so vključeni v ta objavljeni članek in njegove dodatne informacije.Drugi podatki, pomembni za to študijo, so na voljo pri ustreznih avtorjih na razumno zahtevo.
Khan, MJ, Khan, HS, Yousaf, A., Khurshid, K. in Abbas, A. Trenutni trendi v analizi hiperspektralnega slikanja: pregled.Dostop do IEEE 6, 14118–14129.https://doi.org/10.1109/ACCESS.2018.2812999 (2018).
Vaughan, AH Astronomska interferometrična Fabry-Perotova spektroskopija.namestite.Častiti Astron.astrofizika.5, 139-167.https://doi.org/10.1146/annurev.aa.05.090167.001035 (1967).
Goetz, AFH, Wein, G., Solomon, JE in Rock, BN Spektroskopija slik daljinskega zaznavanja Zemlje.Znanost 228, 1147–1153.https://doi.org/10.1126/science.228.4704.1147 (1985).
Yokoya, N., Grohnfeldt, C. in Chanussot, J. Fuzija hiperspektralnih in multispektralnih podatkov: primerjalni pregled novejših publikacij.IEEE Earth Sciences.Revija za daljinsko zaznavanje.5:29–56.https://doi.org/10.1109/MGRS.2016.2637824 (2017).
Gowen, AA, O'Donnell, SP, Cullen, PJ, Downey, G. in Frias, JM Hiperspektralno slikanje je novo analitično orodje za nadzor kakovosti in varnost hrane.Trendi v živilski znanosti.tehnologija.18, 590-598.https://doi.org/10.1016/j.tifs.2007.06.001 (2007).
ElMasri, G., Mandour, N., Al-Rejaye, S., Belin, E. in Rousseau, D. Nedavne aplikacije multispektralnega slikanja za spremljanje fenotipa in kakovosti semena – pregled.Senzorji 19, 1090 (2019).
Liang, H. Napredek pri multispektralnem in hiperspektralnem slikanju za arheologijo in ohranjanje umetnosti.Prijavite se za fizični 106, 309–323.https://doi.org/10.1007/s00339-011-6689-1 (2012).
Edelman GJ, Gaston E., van Leeuwen TG, Cullen PJ in Alders MKG Hiperspektralno slikanje za brezkontaktno analizo forenzičnih sledi.Kriminalistika.notranji 223, 28-39.https://doi.org/10.1016/j.forsciint.2012.09.012 (2012).
Čas objave: 10. januarja 2023